Der erste schriftliche Beleg über Mikulov, dt. Nikolsburg, datiert aus dem Jahre 1173. Bereits im Jahre 1414 hatte Mikulov rund 2500 Einwohner. Zur Stadt zählten damals ein relativ kleiner, von Mauern umfriedeter Kern sowie ausgedehnte Vorstädte. Die Innenstadt wurde in den Jahren 1536 und 1561 von Bränden heimgesucht, denen beinahe die gesamte gotische Bebauung der Stadt zum Opfer fiel.
Die Stadt Mikulov gehörte zunächst von 1249 bis1560 den Liechtensteinern und wurde von ihnen als herrschaftliches Verwaltungszentrum dementsprechend ausgebaut. Von 1575 bis 1945 regierte hier das Haus Dietrichstein, unter dessen Einfluss die Stadt ihre größte Blüte erreichte. Der renaissancezeitliche Umbau hat sich in Mikulov nach 1575 voll entfaltet. Als herausragende Persönlichkeit der Stadtgeschichte gilt Franz Seraph von Dietrichstein, Olmützer Bischof, Kardinal und Fürst. Nachdem er im Jahre 1611 die Regierungsgeschäfte übernommen hatte, hat er sofort damit begonnen, die Stadt in baulicher, wirtschaftlicher und kultureller Hinsicht systematisch umzugestalten, um sie zu einer Residenz zu machen, die seiner Stellung im Staat würdig wäre. Ihm ist es zu verdanken, dass die kleine Provinzstadt vorübergehend zum Zentrum Mährens wurde. Seine Vorliebe für italienische renaissancezeitliche Kultur und die sich daraus ergebende Wahl der Architekten sowie der Baumeister gaben der Stadt einen neuen Charakter. Die vielversprechende Entwicklung von Mikulov geriet ins Stocken, als schwedische Truppen die Stadt im Jahre 1645 eroberten und besetzten. Es folgten negative Auswirkungen der Türken- und Ungarnkriege sowie vernichtende Brände in den Jahren 1663 und 1719.
Dennoch kam die Bautätigkeit in Mikulov nicht zum Erliegen. In der Stadt wirkten renommierte Baumeister und Künstler wie Johann Bernhard Fischer von Erlach, Johann Lucas von Hildebrandt, bzw. später Ignaz Lengelacher. Im Jahre 1784 hat der verheerendste Brand der Stadtgeschichte das barocke Stadtbild schwer beschädigt und dabei über 350 Häuser zerstört. Trotz des langsamen Tempos und des bescheidenen Rahmens, in denen die Stadthäuser nach der Feuersbrunst wieder aufgebaut und umgerüstet wurden, hatte Mikulov im ausgehenden 18. Jahrhundert 7440 Einwohner, die in 760 Häusern lebten.
Als um die Mitte des 19. Jahrhunderts die damals revolutionäre Eisenbahn gebaut wurde, ließ man Mikulov aus: Die Hauptverbindung von Wien nach Brno wurde über Břeclav trassiert. Der über Mikulov führende Handelsweg verlor an Bedeutung. Infolgedessen kam es zu einem Rückgang der Bevölkerung, wobei die meisten Bewohner nach Wien auswanderten. Nach der Auflösung der Patrimonialämter im Jahre 1848 wurden in Mikulov die Bezirkshauptmannschaft und das Bezirksgericht angesiedelt.
Zu den schwärzesten Tagen der Stadtgeschichte zählt der 22. April 1945. An diesem Tag brannte das Schloss Mikulov fast bis auf die Fundamente nieder. Darauf wurde das Schloss einfühlsam erneuert. Der Wiederaufbau erfolgte nach Entwürfen des Architekten Otakar Oplatka, der auch bei der Errichtung von Wohnhäusern in der kriegsbeschädigten Stadt mitwirkte.
Die Kriegsereignisse und die Art und Weise, wie in der Nachkriegszeit mit dem historischen Erbe umgegangen wurde, haben am härtesten den westlichen Teil der Altstadt mit dem Judenviertel getroffen. Hier wurde in den 60er Jahren großflächig (ca. 227 Häuser) demoliert. Auch die Untere Synagoge wurde abgetragen. Nur in der Hus-Str. blieb ein Teil der ursprünglichen Bebauung erhalten. Ab den 60er Jahren wurde Mikulov vor allem in südwestliche Richtung erweitert, wo eine 3-4- stöckige Plattenbausiedlung entstand. Westlich der Stadt wurde in einer weniger exponierten Lage ein Industriegebiet angelegt. Seit 2003 beherbergt Mikulov das im Rahmen der Verwaltungsreform eingeführte, mit zusätzlichen Verwaltungsaufgaben betraute Amt der 3. Stufe.
Dank ihrer geographischen Lage war die Stadt eine Begegnungsstätte für verschiedene kulturelle und religiöse Bewegungen unterschiedlicher Volksgruppen, deren Vermächtnis bis heute in der Stadt sichtbar ist. Nicht nur Tschechen und Deutsche lebten hier friedlich zusammen. Bereits ab der Mitte des 15. Jh. hat sich hier eine bedeutende jüdische Gemeinschaft formiert, die zu den zahlenmäßig stärksten jüdischen Gemeinden Mährens wurde. Im Jahre 1526 haben in Mikulov an die hundert (damals als „Habaner“ bzw. „Hutterer“ bekannte) Täufer Zuflucht gefunden. Mikulov war somit die erste Stadt der Böhmischen Kronländer, in der sie lebten und wirkten.
